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Jul 17, 2023

Analoghi del MOG per esplorare il farmacoforo MCT2, α

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L'α-chetoglutarato (αKG) è un nodo metabolico centrale con un'ampia influenza sulla fisiologia cellulare. L'analogo di αKG N-ossalilglicina (NOG) e il suo derivato pro-farmaco permeabile alla membrana dimetil-ossalilglicina (DMOG) sono stati ampiamente utilizzati come strumenti per studiare le prolil idrossilasi (PHD) e altri processi dipendenti da αKG. Nei terreni di coltura cellulare, il DMOG viene rapidamente convertito in MOG, che entra nelle cellule attraverso il trasportatore del monocarbossilato MCT2, portando a concentrazioni intracellulari di NOG sufficientemente elevate da inibire gli enzimi della glutaminolisi e causare citotossicità. Pertanto, il grado di instabilità (D)MOG insieme ai livelli di espressione di MCT2 determinano gli obiettivi intracellulari con cui NOG si impegna e, in definitiva, i suoi effetti sulla vitalità cellulare. Qui abbiamo progettato e caratterizzato una serie di analoghi del MOG con l'obiettivo di migliorare la stabilità del composto ed esplorare i requisiti funzionali per l'interazione con MCT2, un membro relativamente poco studiato della famiglia SLC16. Riportiamo gli analoghi del MOG che mantengono la capacità di entrare nelle cellule tramite MCT2 e identifichiamo composti che non inibiscono la glutaminolisi o causano citotossicità ma possono comunque inibire i PHD. Usiamo questi analoghi per dimostrare che, nelle nostre condizioni sperimentali, l'attivazione di mTORC1 indotta dalla glutaminolisi può essere disaccoppiata dall'attività del PHD. Pertanto, questi nuovi composti possono aiutare a deconvolure gli effetti cellulari che derivano dall'azione polifarmacologica del NOG.

Lo studio del metabolismo è stato a lungo aiutato dall'uso di analoghi dei metaboliti che consentono l'inibizione rapida e reversibile di enzimi e percorsi in diversi contesti sperimentali1. Nel campo del metabolismo del cancro, composti analoghi come il 2-desossiglucosio, la 6-diazo-5-osso-L-norleucina (DON) e il dicloroacetato (DCA) continuano a integrare gli approcci genetici per analizzare i punti di forza e le vulnerabilità associati all'oncogene cambiamenti metabolici nei tumori2,3,4. Gli analoghi dei metaboliti sono anche tra alcuni dei più importanti composti chemioterapici utilizzati clinicamente: dalla gemcitabina e dal 5-fluoro-uracile (5-FU), analoghi nucleosidici utilizzati come terapie nel cancro del pancreas e del colon-retto; al metotrexato e al pemeterxed, analoghi del folato somministrati per trattare una serie di tumori maligni5,6. Lo sviluppo e il perfezionamento degli analoghi dei metaboliti possono quindi fornire strumenti preziosi per studi meccanicistici sia sul metabolismo che sulla tumorigenesi.

L'α-chetoglutarato (αKG) è un nodo metabolico chiave e la comprensione della sua complessa biologia è stata facilitata dall'analogo strutturale N-ossalilglicina (NOG), che è stato ampiamente utilizzato in vitro insieme al suo derivato permeabile alle cellule, dimetil-ossalilglicina (DMOG )7,8,9 (Fig. 1a). Più comunemente, il DMOG viene utilizzato per suscitare la segnalazione dell'ipossia inibendo gli enzimi del dominio prolil idrossilasi (PHD) che portano alla stabilizzazione del fattore di trascrizione Hypoxia Inducible Factor 1α (HIF1α)8,10. La stabilizzazione dell'HIF1α è un obiettivo terapeutico in condizioni che vanno dall'ischemia e dall'anemia alle malattie infiammatorie11,12 e, in questi contesti, studi precedenti hanno utilizzato DMOG per dimostrare i potenziali benefici terapeutici dell'inibizione dei PHD13,14.

uno schema (creato con Biorender) che descrive le strutture chimiche per DMOG, MOG e NOG, la loro relativa permeabilità cellulare e i bersagli cellulari a seconda delle concentrazioni intracellulari di NOG ([NOG]IC) che suscitano). DMOG viene convertito in MOG e successivamente nell'analogo attivo αKG NOG. Il DMOG è permeabile alle cellule mentre il MOG viene trasportato tramite MCT2 portando a un [NOG]IC più elevato rispetto a quello suscitato dal DMOG. Un valore elevato di [NOG]IC inibisce gli enzimi metabolici oltre ai PHD. I NOG non possono passare attraverso la membrana plasmatica. b Analisi della stabilità del MOG sintetico nel tempo nel sangue intero di topo mediante LC-MS (n = 3 replicati tecnici). c Analisi LC-MS della stabilità del DMOG nel sangue intero di topo nel tempo (n = 3 replicati tecnici). Il DMOG viene convertito molto rapidamente in MOG, anch'esso instabile e successivamente forma NOG con cinetica simile a quella del MOG sintetico misurato in (b). La tabella mostra le emivite calcolate della conversione del DMOG in MOG e successivamente NOG, o della conversione del MOG sintetico in NOG dai dati mostrati nei pannelli (b e c). d Strutture degli analoghi sostitutivi dell'estere metilico del glicinato MOG progettate, sintetizzate e riportate in questo lavoro. (i) esteri alchilici più voluminosi (2,3), (ii) sostituenti α-metilici (4–6), (iii) analogo chetonico (7), (iv) eterocicli aromatici a 5 membri (8–10). e Via sintetica per la preparazione degli analoghi MOG 2-10 mostrati nel pannello (d).